做液相色譜分析時，可能會遇到以下難點：

1. 流動相應(yīng)不改變填料的任何性質(zhì)。低交聯(lián)度的離子交換樹脂和排阻色譜填料有時遇到某些有機相會溶脹或收縮，從而改變色譜柱填床的性質(zhì)。堿性流動相不能用于硅膠柱系統(tǒng)。酸性流動相不能用于氧化鋁、氧化鎂等吸附劑的柱系統(tǒng)。
2. 純度。色譜柱的壽命與大量流動相通過有關(guān)，特別是當(dāng)溶劑所含雜質(zhì)在柱上積累時。
3. 必須與檢測器匹配。使用UV檢測器時，所用流動相在檢測波長下應(yīng)沒有吸收，或吸收很小。當(dāng)使用示差折光檢測器時，應(yīng)選擇折光系數(shù)與樣品差別較大的溶劑作流動相，以提高靈敏度。
4. 有機溶劑使用量。一般先用90%的乙腈或甲醇/水或緩沖溶液進行試驗，這樣可以很快地得到分離結(jié)果，然后根據(jù)出峰情況調(diào)整有機溶劑的比例。每減少10%的有機溶劑的量，保留因子約增加3倍，此為三倍規(guī)則。
5. 調(diào)整過程。當(dāng)分離達到一定程度，應(yīng)將有機溶劑10%的改變量調(diào)整為5%，并據(jù)此規(guī)則逐漸降低調(diào)整率，直至各組分的分離情況不再改變。

這些難點是液相色譜分析中需要注意和克服的方面，通過不斷實踐和積累經(jīng)驗，可以逐漸提高液相色譜分析的效率和準確性。