2.保留時(shí)間問題
|
可能致因 |
預(yù)防措施/解決方案 |
|
減少保留時(shí)間 |
|
|
鍵合固定相的損失 （流失） |
|
|
固定相上的（存在）活性基團(tuán) |
|
|
增加流量 （流速） |
|
|
柱超載 （色譜柱過載） |
|
|
延長保留時(shí)間 |
|
|
改變流動(dòng)相的成分 |
|
|
鍵合固定相的損失 （流失） |
|
|
減少流量 （流速） |
|
|
流動(dòng)相中存在氣泡 |
|
|
波動(dòng)保留時(shí)間 |
|
|
柱平衡（色譜柱平衡時(shí)間）不足 |
|
|
流動(dòng)相成分的變化 |
|
|
緩沖能力不足 |
|
|
波動(dòng)柱的溫度 （柱溫波動(dòng)） |
|
2. 保留變量（時(shí)間變動(dòng)）
如果所有峰（色譜峰）的保留時(shí)間均發(fā)生了變化，其致因很可能是如下因素發(fā)生了變化：流動(dòng)相的組成、色譜柱的化學(xué)性質(zhì)、色譜柱的溫度或流速。
如果等度或梯度流動(dòng)相在在線式混合中出現(xiàn)錯(cuò)誤，也可能導(dǎo)致保留時(shí)間出現(xiàn)問題。
下面將簡要介紹這些問題來源（對(duì)上述每個(gè)原因都簡述如下）。
2.1.如果操作人員操作不當(dāng)，則會(huì)導(dǎo)致流動(dòng)相組成的意外變化，例如使用在線式混合系統(tǒng)時(shí)，流動(dòng)相混合物（系統(tǒng)）設(shè)置不正確；或替換新批次流動(dòng)相時(shí)，未妥善制備新的流動(dòng)相（新流動(dòng)相配制不正確）。
在極少數(shù)情況下，會(huì)出現(xiàn)流動(dòng)相組分選擇性損失的情況，例如蒸發(fā)。
當(dāng)流動(dòng)相發(fā)生變化時(shí)，峰形（色譜峰）通常會(huì)向相同的方向移動(dòng)，以縮短或延長保留時(shí)間（保留時(shí)間變長或變短）；而相對(duì)保留（選擇性因子，a）通常會(huì)發(fā)生變化。
檢查流動(dòng)相組成錯(cuò)誤的最佳方法是仔細(xì)檢查（復(fù)查）系統(tǒng)設(shè)置；如有必要，應(yīng)制備新的流動(dòng)相。
方法文件應(yīng)包含特定流動(dòng)相變化影響的相關(guān)信息。例如，有機(jī)溶劑或pH值的微小變化會(huì)對(duì)色譜圖產(chǎn)生特征（在色譜圖體現(xiàn)出特征性的）影響，如分辨率或保留的變化（分離度的變化或保留時(shí)間的漂移）。
如果您懷疑設(shè)備出現(xiàn)故障，請(qǐng)將色譜柱和流動(dòng)相移至另一個(gè)HPLC系統(tǒng)，然后再次運(yùn)行。
如果問題依然存在，則問題在于流動(dòng)相或色譜柱；如果問題不再出現(xiàn)，則可能與其他系統(tǒng)組件或參數(shù)相關(guān)。
2.2.色譜柱化學(xué)（化學(xué)性質(zhì)）變化會(huì)在色譜柱的整個(gè)生命周期內(nèi)出現(xiàn)，并且一般會(huì)在數(shù)周或數(shù)月內(nèi)逐漸變化。柱老化一般伴隨著柱背壓的上升、保留時(shí)間的逐漸變化（漂移）（更長或更短）以及更多的峰拖尾。
更換新柱以確定是否是柱老化導(dǎo)致的問題（可確證色譜柱老化）。
500-2000次注射（進(jìn)樣）的柱壽命是較為理想的；在這一點(diǎn)上，柱成本相較于整體分析，是十分微小的，所以更換新柱的可行性較高（色譜柱在整個(gè)分析的成本中所占比例低，因而可以合理更換色譜柱）。
如果色譜柱的使用壽命過短，應(yīng)仔細(xì)檢查操作條件，以確保它們適用于該色譜柱。
圖5顯示了在極端操作條件下，色譜柱壽命較短的示例（縮短的壽命）。
2.3.色譜柱溫度變化會(huì)導(dǎo)致保留時(shí)間的變化：每1°C的溫度變化會(huì)引起1-3％的保留時(shí)間變化。如果不使用柱溫箱（即“室溫”條件），由于實(shí)驗(yàn)室溫度的變化，溫度通常會(huì)在日間（和夜間）循環(huán)（周期性）變化。
雖然在室內(nèi)恒溫器的測(cè)量下，實(shí)驗(yàn)室溫度顯示為恒定，但是HPLC系統(tǒng)的微觀（微）環(huán)境可能會(huì)發(fā)生顯著變化，尤其是當(dāng)供暖或空調(diào)通風(fēng)口直接吹向系統(tǒng)時(shí)，溫度變化極為明顯。
使用柱溫箱可以避免色譜柱出現(xiàn)這樣的溫度問題，且HPLC系統(tǒng)應(yīng)遠(yuǎn)離通風(fēng)口放置。
2.4.流量（流速）問題可能是因存在氣泡、泄漏或泵問題（故障）導(dǎo)致的。
氣泡問題應(yīng)和低壓（或脈動(dòng)壓力）以及保留時(shí)間的增加相關(guān)（可能伴有柱壓過低或柱壓波動(dòng)，且保留時(shí)間延長）。
對(duì)于雙頭泵，如果只有一個(gè)泵頭存在氣泡，則流量和壓力可能會(huì)發(fā)生脈動(dòng)（跳動(dòng)）。
應(yīng)對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行脫氣，然后打開放氣閥清空泵，并向泵中多次加入5-10mL的流動(dòng)相，以正常流速流經(jīng)泵，從而排出氣泡（打開排氣閥以正常流速的幾倍泵入5-10ml流動(dòng)相經(jīng)過泵，以排出氣泡）。
在某些情況下，可能需要使用低粘度的脫氣溶劑，如甲醇（MeOH）或乙腈（ACN）來清除泵中頑固的氣泡。
泄漏也會(huì)延長保留時(shí)間。配件（接頭）上的滴水配件或玻璃體內(nèi)的結(jié)晶沉淀都是泄漏的證據(jù)（查看接頭如有液滴或結(jié)晶析出，可證明有泄露）。
請(qǐng)?zhí)貏e注意色譜柱上游的配件（之前的接頭）。
自動(dòng)進(jìn)樣器內(nèi)的配件和密封件（接頭和密封圈）可能難以檢測(cè)，可借助手電筒和小鏡子進(jìn)行檢查。
如果使用不銹鋼配件，通常1/4的緊固螺母（將接頭螺好再擰緊1/4圈）便可以阻止泄漏。
使用PEEK配件（接頭）時(shí)，應(yīng)停止泵，松開接頭，將管子推到配件（接口）端口的底部，然后在重新啟動(dòng)泵之前擰緊配件（接頭）。
擰緊PEEK配件（接頭）時(shí)如果存在流動(dòng)的液體，會(huì)導(dǎo)致管道在配件中滑動(dòng)，產(chǎn)生柱外死體積，進(jìn)而影響分離效果。
存在缺陷的止回閥（單向閥）或磨損的泵密封件（圈）會(huì)導(dǎo)致流量偏低或波動(dòng)。
止回閥（單向閥）出現(xiàn)問題將導(dǎo)致壓力的波動(dòng)。如果在清除泵中氣泡后還無法改善壓力波動(dòng)的情況，則止回閥（單向閥）可能存在故障。
可以更換新的止回閥（單向閥）；也可以將止回閥（單向閥）放置在（裝有）MeOH的燒杯中，對(duì)其進(jìn)行超聲處理，以實(shí)現(xiàn)有效的清潔。
如果無法有效區(qū)分入口端和出口端之間的止回閥（如不易分清入口單向閥和出口單向閥），請(qǐng)劃線標(biāo)記或用標(biāo)簽標(biāo)記燒杯。將每個(gè)止回閥（單向閥）放入單獨(dú)的燒杯中進(jìn)行清潔，使其分開清潔。如果部件滑出，應(yīng)小心組裝，以免受到污染（無塵手套，避免劃傷部件等）。
隨著使用時(shí)間的增加，泵密封件（圈）會(huì)出現(xiàn)磨損；而且使用緩沖流動(dòng)相或?qū)⑵渲糜诟啕}條件下（例如離子交換法），會(huì)縮短它的使用壽命。
您可以建立一個(gè)預(yù)防性維護(hù)計(jì)劃，定期更換密封件并做相應(yīng)記錄（準(zhǔn)確記錄更換密封圈的時(shí)間間隔，就可以建立預(yù)防性的維護(hù)計(jì)劃），從而在故障發(fā)生前更換密封件。如果無其它指標(biāo)（征兆），應(yīng)至少每年更換一次密封件（圈）。
2.5.比例閥和在線混合發(fā)生故障會(huì)降低梯度洗脫的效果（使梯度洗脫效果變差）。
圖6示例顯示了兩次連續(xù)注射肽樣品的梯度洗脫分析。在這種情況下，系統(tǒng)適用性測(cè)試允許兩次運(yùn)行之間存在0.1分鐘的變化（保留時(shí)間變化）；第一個(gè)峰值不符合該標(biāo)準(zhǔn)，最后一個(gè)峰值勉強(qiáng)通過而中間兩個(gè)峰值明顯超出規(guī)定值。
圖6. 兩個(gè)連續(xù)梯度運(yùn)行的（兩次連續(xù)梯度洗脫）色譜圖顯示了梯度中點(diǎn)附近的峰形具有較大的誤差（保留時(shí)間的誤差較大）（13分鐘）。來源[3]。
下面介紹了一種檢查流動(dòng)相配比（混合）精度的簡單方法。
將柱更換為0.005英寸直徑約1米長（0.12mm）的管道（取下色譜柱，換上長約1米，內(nèi)徑0.005英寸（0.12mm）的管路），在A容器中加水，且B容器中放有含有0.1％丙酮的水，將檢測(cè)器波長設(shè)置為265nm，并使用足夠高的流速使止回閥（單向閥）能夠有效工作（例如2mL/min）。
以10％為增量運(yùn)行一系列梯級(jí)（梯級(jí)實(shí)驗(yàn)）（10％、20％、30％……90％、100％B）。
由于問題經(jīng)常出現(xiàn)在50％B附近，所以在45％B和55％B處增添了額外的梯級(jí)。
其結(jié)果應(yīng)是平滑的階梯狀（參見圖8a）。
對(duì)于圖6的樣品，在40％-60％B的梯級(jí)中觀察到圖7的曲線。
梯級(jí)是扭曲的（已變形），且45％到50％B的梯級(jí)（梯級(jí)變化）是8.4％而不是5％。
圖7中的虛線近似于（擬合了該）梯度，同時(shí)（在）45％和50％B之間存在偏移。
因此，此處應(yīng)是由具有較大保留變量的峰被洗脫導(dǎo)致的（不幸的是，這正是那些保留時(shí)間偏差較大的峰出峰的位置）。
HPLC系統(tǒng)可對(duì)比例閥進(jìn)行調(diào)節(jié)。
當(dāng)執(zhí)行此操作時(shí)，梯級(jí)會(huì)變得平滑且保留時(shí)間也會(huì)處于規(guī)格范圍之內(nèi)。
圖7. 在圖6的梯度中點(diǎn)附近執(zhí)行配比（比例）階梯測(cè)試的結(jié)果。理論值顯示在括號(hào)內(nèi)。來源[3]。
如果系統(tǒng)性能良好，其階梯測(cè)試的結(jié)果應(yīng)與圖8a類似，在整個(gè)圖中呈現(xiàn)階梯狀。
未注射的0-100％B梯度是應(yīng)運(yùn)行的對(duì)比測(cè)試（另需同時(shí)進(jìn)行一無進(jìn)樣的0-100%B梯度試驗(yàn)）。
它應(yīng)顯示為線性基線、線性梯度部分和線性后期梯度保持，每個(gè)部分之間均是平滑的曲線過渡（線性梯度部分以及一段梯度升高后維持直線，每兩段之間為平滑曲線過度）。
圖9的示例顯示了在約25％、50％和75％B的線性（箭頭）條件下，空白梯度運(yùn)行呈現(xiàn)有規(guī)律的偏移。
圖8. 圖9顯示了HPLC系統(tǒng)的梯度階梯測(cè)試結(jié)果。（a）0、10、20、30、40、45、50、55、60、70、80、90和100％B的梯級(jí)；（b）以1％的梯級(jí)向上跟蹤至45-55％。箭頭顯示了50和51％之間的“較短”梯級(jí)。來源[4]。
與這些條件相對(duì)應(yīng)的階梯測(cè)試如圖8a所示，并且在這個(gè)度量（放大比例）下表現(xiàn)良好。
為了更仔細(xì)地檢查問題區(qū)域，在45-55％B范圍內(nèi)以1％的增量進(jìn)行階梯測(cè)試，如圖8b所示。
這個(gè)擴(kuò)展（放大）圖清楚地顯示了在50％和51％之間的梯級(jí)中，存在不規(guī)則性。
在線性圖中的定期（有規(guī)律間隔的）誤差（圖9）表明，控制比例閥的算法或比例閥本身存在問題。
在目前的情況下，調(diào)整控制（控制軟件）軟件無法解決問題，因此應(yīng)更換比例閥，以解決問題（因此更換了比例閥，問題被解決）。
圖9. 故障比例閥線性梯度圖。箭頭顯示線性偏離；繪制下面的虛線以供參考（虛線為標(biāo)準(zhǔn)參考線）。以1mL/min的速度運(yùn)行梯度0-100％B 15分鐘；A =水、B = 0.1％丙酮水溶液；檢測(cè)UV 265nm。來源[4]。
盡管可以假設(shè)單一來源是導(dǎo)致特定HPLC問題的原因（雖然通?？梢约俣矵PLC問題只有一個(gè)故障原因），但情況并非總是如此。
圖10a顯示了以非常淺的梯度（30分鐘內(nèi)19-24％ACN）連續(xù)三次注射肽樣品的結(jié)果（顯示了一種多肽樣品三次連續(xù)進(jìn)樣，窄梯度洗脫（30分鐘內(nèi)19-24%乙腈梯度洗脫））。
由于懷疑存在流量（流速）問題，因此在雙活塞雙泵系統(tǒng)中更換了所有8個(gè)止回閥（單向閥）和4個(gè)泵密封件（圈）。
這大大改善了保留變量（保留時(shí)間大為改善），保留范圍從2.1分鐘變化到1.0分鐘（圖10b），但仍然是（此偏差仍）不可接受的。
為了進(jìn)一步研究問題，將溶劑預(yù)混合到裝有15% ACN的A容器和裝有25％ACN的B容器中（在A瓶中預(yù)混合15% 乙腈，在B瓶中預(yù)混合25% 乙腈）。
當(dāng)調(diào)整儀器設(shè)置以產(chǎn)生與圖10a和b相同的梯度時(shí)，獲得圖10c所示的結(jié)果。盡管儀器的配比精度在±0.1％的規(guī)格范圍內(nèi)，但對(duì)于非常淺（窄）的梯度來說仍是不夠的。
預(yù)混合溶劑將有效精度從0.1％提高至0.01％，如果該樣品希望具有令人滿意的保留時(shí)間再現(xiàn)性，這點(diǎn)是必需的。
預(yù)混合可以提高系統(tǒng)性能，以滿足苛刻的分離要求。
圖10.三次連續(xù)注射肽樣品的擴(kuò)充（放大）色譜圖。產(chǎn)生的色譜圖：（a）使用原始系統(tǒng)配置（b）更換所有止回閥（單向閥）和泵密封件（圈）后（c）使用預(yù)混流動(dòng)相。色譜柱：250×4.6mm、5 mC18以1.5mL/min和35℃運(yùn)行，并在215nm檢測(cè)。梯度：30分鐘內(nèi)19-24％ACN / 0.1％TFA的水溶液。來源[5]。
